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細胞分裂素是一類植物激素,它能夠促進細胞分裂,并誘導根系發(fā)芽和植株生長。它主要分布在植物的根尖、莖尖、未成熟的種子、剛萌發(fā)的種子、正在生長的果實內(nèi)部。植物體內(nèi)天然的細胞分裂素有玉米素、二氫玉米素、異戊烯腺嘌呤、玉米素核苷、異戊烯腺苷等。植物中的細胞分裂素在根尖內(nèi)合成,通過木質部轉運到地上的部分。主要代謝反應有:從堿基形成核苷和核苷酸、葡萄糖基化、甲硫基化、嘌呤環(huán)側鏈分裂和嘌呤環(huán)分解。細胞分裂素和細胞的分裂密切相關,研究發(fā)現(xiàn),在擬南芥的根系中,細胞分裂素通過控制擬南芥主根分生組織區(qū)的細胞分化速度,來影響分生組織區(qū)的大小。
檢測植物細胞分裂素的方法,主要包括高效液相色譜(HPLC)法、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法等。這里簡單的介紹一下,
1.高效液相色譜(HPLC)法
取新鮮的植物組織,要新鮮的,細胞分裂素比較多。在液氮中冷凍,并將冷凍組織取出來研磨成粉末,并在甲醇:氯仿:甲酸混合溶液中勻漿,離心提取上清液,除去有機溶劑,可以獲得細胞分裂素提取物,并對其進行純化處理。
HPLC檢測細胞分裂素,色譜條件是必須的,也是必要的。比如C18的色譜柱,乙腈-三乙胺緩沖液為流動相,梯度洗脫,柱溫35℃,檢測波長270nm,進樣量10ul等。
標準曲線的制作:測定細胞分裂素含量,這里用到外標法。
細胞分裂素是一類物質,它包含了玉米素、玉米素核苷、6-r,r-二甲基烯丙基氨基嘌呤和6-r,r-二甲基烯丙基氨基嘌呤核苷。那就用這4種物質的標準品,分別進行梯度稀釋5個不同的點,按上述的色譜條件,進樣測定并記錄色譜圖和數(shù)據(jù)。以色譜峰面積為縱坐標,對應的濃度為橫坐標,繪制標準曲線。
對樣品進行上機檢測,根據(jù)情況可以做樣本平行,對檢測結果求取平均值。根據(jù)標準曲線,可以計算出樣品中的細胞分裂素含量。但是,這個時候要注意一個問題,就是一定要考慮上回收率,數(shù)據(jù)才相對準確。
2.酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法
ELISA是采用雙抗體夾心法測定樣品中的細胞分裂素含量。用植物細胞分裂素捕獲抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被的微孔中依次加入細胞分裂素,再和HRP標記的檢測抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化為藍色,并在酸的作用下終止為黃色。顏色的深淺和樣品中的植物細胞分裂素濃度成線性關系,在酶標儀450nm波長下測定吸光度值,并通過標準曲線計算樣品中植物細胞分裂素的含量。