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花青素還原酶檢測(cè)方法
來源: | 作者:上海優(yōu)選生物 | 發(fā)布時(shí)間: 2024-07-18 | 191 次瀏覽 | 分享到:

植物花青素還原酶是原花青素合成途徑的關(guān)鍵酶之一,它可以使花色素轉(zhuǎn)變?yōu)橄鄳?yīng)的相應(yīng)的順式黃烷-3-醇。此舉,有利于植物體內(nèi)類黃酮物質(zhì)的合成,以及花色苷的積累。檢測(cè)樣品中花青素還原酶含量,有兩種方法。一種是比色法,花青素還原酶能夠催化NADPH和花色素轉(zhuǎn)化為黃烷-3-醇和NADP+,NADPH在340nm的地方有吸收峰,而NADP+沒有。此時(shí),在340nm的檢測(cè)波長(zhǎng)處,測(cè)定NADPH的下降速率,就可以計(jì)算出樣品中的花青素還原酶含量了。



這里還有一種方法,就是酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法。將待測(cè)的樣品的標(biāo)準(zhǔn)品和樣品,加入到微孔板的微孔內(nèi)進(jìn)行測(cè)定。先將待測(cè)物質(zhì)和生物素標(biāo)記的抗體結(jié)合,并同時(shí)溫育。洗滌后,加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌,去除沒有結(jié)合的酶結(jié)合物。最后,加入底物A、B、和酶結(jié)合物。反應(yīng)后,會(huì)產(chǎn)生顏色。這個(gè)顏色的深淺與待測(cè)物的濃度是有線性關(guān)系的,可以根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定的線性關(guān)系,制作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù),結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以計(jì)算出樣品中的花青素還原酶含量。



ELISA試劑盒,要先看一下說明書。試劑盒有保存方法和有效期,確保它在使用之前和使用中都是有效、可靠的。在使用之前,有的需要平衡到室溫狀態(tài)。樣本和標(biāo)準(zhǔn)品稀釋方式和吸取量,都有詳細(xì)的要求,這里就不一一描述了。



需要注意的是,在酶標(biāo)儀450nm波長(zhǎng)處讀取數(shù)據(jù),以吸光度為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)品為橫坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品要恰當(dāng)處理,并按步驟檢測(cè),根據(jù)酶標(biāo)儀測(cè)定的數(shù)據(jù),結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線,可以計(jì)算樣品中所含有的花青素還原酶含量。說明書,其實(shí)也是在考驗(yàn)做實(shí)驗(yàn)的基本功了。如果基礎(chǔ)不扎實(shí),對(duì)說明書的要求也會(huì)放松,認(rèn)真按順序去完成即可。


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