www.freetripdeals.com
乙酰輔酶a,簡寫為CoA。它是輔酶A的乙?;问?,或者活化了的乙酸。它是脂肪酸β氧化,以及糖酵解后產生的丙酮酸氧化脫羧的產物。在很多的代謝過程中,CoA都起著比較關鍵的作用。糖類,脂肪,蛋白質徹底氧化,都會產生CoA,之后進入到三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化,最終生成二氧化碳和水,釋放出能量用于ATP的合成。CoA是合成脂肪酸、酮體、膽固醇及衍生物的前體物質。
檢測方法包括高效液相色譜(HPLC)法、質譜(MS)法、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法等。
1.HPLC
獲取新鮮的植物樣本,用液氮冷凍后,加入聚乙烯聚吡咯烷酮,去除多酚,防止樣品氧化。接著,研磨成粉末狀。稱量,加入純水,振蕩混勻,離心,取上清液,過0.22um濾膜,待測。具體步驟,可以參考相關的檢測方法。
色譜條件:C18的色譜柱,設置35-40℃的柱溫;以甲酸銨和乙腈為流動相(等度洗脫),0.5-1ml/min,紫外檢測器,進樣量10-20uL。
標準曲線:標曲是一種外標法,目前在科研檢測過程中使用較為普遍,它能更準確的計算出樣品中的CoA的含量。采用5-7個點,讓它們在檢測器優(yōu)良的檢出限范圍內。以色譜峰的積分面積為縱坐標,對應的標準溶液濃度為橫坐標,可以繪制出標準曲線?;貧w方程的相關系數(shù)r2>0.999,近似于直線。它就像一把尺子,尺子做好了,就要測量樣品了。
樣品測定:將處理好的樣品,根據(jù)摸索出來的較好的色譜條件,和標準品相同的方法,測出色譜峰。對峰面積進行積分,結合標準曲線的回歸方程,可以計算出乙酰輔酶a的含量。這里需要注意的是要考慮稀釋倍數(shù),回收率,重復性等要素。
2.質譜法
一般是串聯(lián)了液相色譜,即LC-MS的形式測定。需要設置電離源模式,比如ESI,正離子模式,氮氣,霧化氣壓力,ESI的電壓,干燥氣的溫度和流速,監(jiān)測模式如多反應監(jiān)測(MRM)等,根據(jù)測定出來的質譜峰,確定目標化合物。根據(jù)標準曲線,可以更準確的計算出樣品中的乙酰輔酶A的含量。
3.酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法
往預先包被乙酰輔酶a的微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的乙酰輔酶a呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。具體操作步驟,參考相關的檢測說明書。