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NADPH 氧化酶（NADPH oxidase）試劑盒
（微板法 48 樣）

一、產(chǎn)品簡(jiǎn)介： 

        NADPH 氧化酶（NAO）是一個(gè)典型的膜蛋白，催化 NADPH 氧化生成 NADP +，并 將電子傳遞給氧原子從而產(chǎn)生超氧陰離子。廣泛存在于動(dòng)物、植物和真菌中。該酶異常 可導(dǎo)致人慢性肉芽腫?。?/span>GCD），在植物中，該酶與其抗病性和各種脅迫有密切關(guān)系。 NADPH 氧化酶（NAO）將 NADPH 氧化為 NADP +的同時(shí)生成超氧陰離子(O2 . - )，接 著與顯色劑反應(yīng)生成水溶性的黃色物質(zhì)。對(duì)照通過添加該酶的特異性抑制劑 DPI 排除背 景值。最終檢測(cè)生成的有色物質(zhì)在 450nm 處的吸光值，即可計(jì)算得出 NAO 酶活性大小。 

二、試劑盒組分與配制： 

三、所需的儀器和用品：

  酶標(biāo)儀、96 孔板、低溫臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、研缽、冰、蒸餾水。 

四、NADPH 氧化酶（NAO）活性測(cè)定：

   建議正式實(shí)驗(yàn)前選取 2 個(gè)樣本做預(yù)測(cè)定，了解本批樣品情況，熟悉實(shí)驗(yàn)流程，避免實(shí)驗(yàn) 樣本和試劑浪費(fèi)！

1、樣本制備

① 組織樣本：

  取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液，在 4oC 或冰浴進(jìn)行勻漿(或使用各類常見勻漿器)。 4oC×12000rpm 離心 10min，取上清作為待測(cè)液。 【注】：若增加樣本量，可按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例進(jìn)行提取.

② 細(xì)菌/細(xì)胞樣本： 

  先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；取約 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）； 12000rpm 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。 【注】：若增加樣本量，可按照細(xì)菌/細(xì)胞數(shù)量（10 4）：提取液（mL）為 500~1000：1 的比例進(jìn)行提取。

③ 液體樣本：

   直接檢測(cè)；若渾濁，離心后取上清檢測(cè)。

2、上機(jī)檢測(cè)：

1  酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min  以上，設(shè)定溫度 37℃ , 調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 450nm。

2  所有試劑解凍至室溫（25℃)。

③ 在 96 孔板中依次加入：

【注】若△A 的值在零附近，可以延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間 T（如至 40min 或更長(zhǎng)），則改變后的反應(yīng) 時(shí)間 T 需代入公式重新計(jì)算

五、結(jié)果計(jì)算：

1 、按樣本蛋白濃度計(jì)算：

酶活定義：每毫克組織蛋白每分鐘在反應(yīng)體系中使 450nm 處吸光值變化 0.01 為一酶活單位。

NAO(△OD450/min/mg prot）=ΔA÷（V1×Cpr）÷0.01÷T=250×ΔA÷Cpr

2 、按樣本鮮重計(jì)算：

酶活定義：每克組織每分鐘在反應(yīng)體系中使 450nm 處吸光值變化 0.01 為一酶活單位。

NAO(△OD450/min/g  鮮重）=ΔA÷(W ×V1÷V) ÷0.01÷T=250×ΔA÷W

3 、按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

酶活定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘在反應(yīng)體系中使 450nm 處吸光值變化 0.01 為一酶活 單位。

NAO(△OD450/min / 104 cell）=ΔA÷(500×V1÷V) ÷0.01÷T=0.5 ×ΔA

 V---加入提取液體積，1mL；           V1---加入樣本體積，0.02mL；

T---反應(yīng)時(shí)間，20min ；                W---樣本質(zhì)量，g；

500---細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬；

Cpr---樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；建議使用本公司的 BCA 蛋白含量檢測(cè)試劑盒。

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